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        蛋白質組學

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        北京蛋白質組學——「青蓮聚焦」方法決定效率,生物藥表征之準確分子量

        2021-11-01 18:50:01

        北京蛋白質組學



        分子量一般指相對分子質量,分子量是有機化合物基本的理化性質參數,分子量正確與否往往代表著所測定的有機化合物及生物分子的結構正確與否,因此也是產品報批的重要數據之一。

        蛋白或多肽藥物具有結構復雜且高度非均一性的特點,其開發和生產過程復雜,面臨很多不可控因素,為了確保產品保障有效,須進行多方面的表征。準確的氨基酸序列、分子量、價態變化、糖基化、聚集水平以及氧化水平都是蛋白質藥物表征的關鍵要素。例如:單克隆抗體被認為是具有高度特異性的靶向藥物,其對腫瘤細胞的靶向性非常高??贵w-藥物偶聯物(Antibody-drug conjugates,以下簡稱 ADCs)技術,就是在抗體蛋白的特定氨基酸上偶聯具有抗腫瘤作用的化療藥物(或稱小分子藥物),以增加單克隆抗體的療效、并降低小分子藥物的毒性。相比單克隆抗體,ADCs 藥物的生產工藝更為復雜,因此為了保證 ADCs 藥物的保障性和有效性,需對 ADCs 藥物的質量進行監控。藥物抗體比(drug to antibody ratio,以下簡稱DAR)是評價 ADCs 藥物的生產工藝和產品質量的一個重要參數。其中MS檢測方法因其快速、靈敏度高和強大的定性功能等優點,愈來愈廣泛地被用于測定 ADCs 的 DAR。



        北京蛋白質組學



        隨著非變性質譜(Native MS)技術的不斷發展和推廣,采用非變性質譜進行cysteinelinked ADCs分析顯示了強大的應用潛力。Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 質譜儀保持了Orbitrap 高分辨率、高質量精度的優勢,分辨率高達140,000 FWHM,能夠實現同分異構體的分離和糖基化狀態的測定,同時擴展質量數范圍至 m/z 20,000,實現了較大蛋白質、抗體、抗體-藥物偶聯物、糖型和北京蛋白質組學的分析,適用于測定蛋白和蛋白復合物在天然結構狀態下的分子量。

        高分辨質譜法(EMR)分子量檢測方法

        儀器:Exactive Plus EMR 質譜

        數據處理軟件:ProteinDeconvolution(v4)

        結果展示



        表 1 送檢樣品分子量 LC-MS 檢測結果


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        樣本的TIC圖




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        樣本XXX的相對分子質量圖



        樣品要求:蛋白純度>百分之95;蛋白質量>100 μg,濃度0.5μg/μL以上。

        生物藥表征之等電點

        等電點是一個分子表面不帶電荷時的pH值。蛋白質是兩性電解質,其等電點和它所含的酸性氨基酸和堿性氨基酸的數量比例有關。當溶液在某一特定pH值的條件下,蛋白質所帶正電荷與負電荷恰好相等(總凈電荷為零)時,在電場中既不向陽移動,也不向陰移動。

        隨著現代醫藥工業的發展,出現了大量的蛋白質和多肽類藥物分子,等電點是其重要的理化參數,對這些蛋白質多肽類藥物分子等電點的分析已成為醫藥工業質量控制的重要環節。例如:在復合抗體藥物的質量控制中,各單克隆抗體組分的含量是保證產品的藥效、標志著性和批間重復性的重要指標。由于各單克隆抗體通常具有較高比例的同源序列,其分子量、分子結構和理化性質非常接近,常用的多數分析方法如體積排阻色譜、毛細管凝膠電泳等方法均無法區分這些不同的單克隆抗體組分,因而不適用于復合抗體藥物的組成和含量分析這一目的。等電點是單克隆抗體的固有性質之一,不同的單克隆抗體由于氨基酸組成、序列和空間結構不同,等電點通常具有明顯的差異,因而可以利用不同單克隆抗體的等電點差異對其進行分離和定量。毛細管等電聚焦 (cIEF) 在毛細管電泳技術測定兩性物質等電點的基礎上,實現對樣品中不同組分的等電點分離和檢測。

        電荷變化是測定單抗藥物降解變靈敏快速的方法之一,已經被國內外生物制藥企業廣泛采用。

        等電點檢測方法

        全柱成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)為Proteinsimple全景式動態等電聚焦分析技術,已經成為等電點檢測及電荷異質性分析的行業金標準。

        實驗儀器和材料

        Proteinsimple公司Maurice快速全自動蛋白質表征分析系統

        實驗原理

        通過毛細管等電聚焦電泳,將樣本中蛋白質基于等電點不同而分離,280nm的紫外光照射下CCD檢測器檢測不同等電點蛋白質的光吸收峰,從而得到該樣本中蛋白質的特征譜形。

        結果展示



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        利用iCIEF監視貯存過程中蛋白的電荷異質性,作為產品穩定性評估的一部分。結果顯示,在3個月的存儲期間(22℃),CRM197的酸性峰(pI 5.77和5.82)增加,而主峰(pI 5.9)降低

        樣品要求:蛋白純度>百分之90;蛋白質量>100 μg,濃度0.5μg/μL以上。

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